免疫組織化學 (IHC) – 實驗方案

免疫組織化學是免疫染色在組織學中的重要應用。它需要使用與生物組織中的這些抗原結合的抗體來特異性檢測細胞中的抗原。組織樣本通過石蠟包埋或福爾馬林固定方法固定，并用抗原修復劑進行預處理。預處理對于通過破壞福爾馬林誘導的抗原交聯來改善抗原的表達至關重要。然后封閉載玻片以減少背景，并可以通過直接標記或間接測定進行染色。

脫蠟

1. 將載玻片在 60°C 孵育 60 分鐘。

2. 在二甲苯中脫蠟 10 分鐘，然后再重復一次。

3. 在 100% 酒精中水合 5 分鐘，然后在 95% 酒精中水合 5 分鐘，然后在 85% 酒精中水合 5 分鐘，然后在 75% 酒精中水合 5 分鐘。

4. 浸入蒸餾水中5分鐘

5. 浸入 TBS（50 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.6）中，放置 5 分鐘，然后重復兩次。

抗原修復

1. 將 500-2000 ml 10 mM 檸檬酸鹽緩沖液 (pH6.0) 在不銹鋼高壓鍋中煮沸。

2. 將載玻片放入染色架中，然后放入高壓鍋中，確保載玻片充分浸入檸檬酸鹽緩沖液中。

3. 3-4 分鐘后，當壓力指示閥上升時，孵育 1 分鐘。

4. 將載玻片自然冷卻至室溫。

5. 浸入蒸餾水中，放置 5 分鐘，重復兩次。

6. 將載玻片浸入 TBS 中 5 分鐘，然后重復兩次。

7. 在室溫下將載玻片浸入 3% H2O2（新鮮甲醇中）15 分鐘。

8. 用蒸餾水清洗兩次，每次5分鐘。

9. 用TBS（pH 7.6）洗滌兩次，每次5分鐘。

一抗染色

1. 用 TBS 中的 3% BSA 稀釋一抗。用稀釋的一抗覆蓋載玻片上的組織切片（每張載玻片使用 50-150 μl）。

2. 37℃孵育30分鐘或室溫60分鐘（最佳孵育時間、孵育溫度和抗體稀釋度應由各個實驗室確定）。

3. 用TBS洗滌兩次，每次5分鐘。

二抗染色

1. 與 100-200μl 聚合物增強劑一起孵育 37C 孵育 30 分鐘

2. 用TBS洗滌3次，每次5分鐘。

3. 與 100 200μl 聚合 HRP 一起孵育，并在 37C 下孵育 30 分鐘

4. 用TBS洗滌3次，每次5分鐘。

5. 加入dAb溶液，孵育3-10分鐘（反應進度和最佳時間應根據顯微鏡確定）。

6. 用蒸餾水清洗2次，每次5分鐘。

7. 如果需要，用蘇木精復染切片，用蒸餾水清洗。將玻片浸入 0.1% HCl 乙醇中 1-10 秒，用蒸餾水清洗。

8. 95%乙醇脫水1分鐘，100%乙醇脫水2×3分鐘，二甲苯脫水2×3分鐘，蓋玻片封固劑。