蛋白質印跡實驗方案

裂解緩沖液：

為了準備在凝膠上運行的樣品，需要裂解細胞和組織以釋放感興趣的蛋白質。這會溶解蛋白質，使它們可以單獨遷移通過分離凝膠。我們使用 RIPA 緩沖液 (beyotime P0013B) 來提取全細胞提取物和膜結合蛋白。

蛋白酶和磷酸酶抑制劑：

一旦發生裂解，蛋白水解、去磷酸化和變性就開始。如果樣品始終保存在冰上或 4°C 下，并且將適當的抑制劑新鮮添加到裂解緩沖液中，這些事件可以大大減慢。 Pmsf是我們經常使用的蛋白酶抑制劑。

組織裂解液的制備

用干凈的工具解剖感興趣的組織，最好在冰上，并盡可能快地防止蛋白酶降解。均質化前應將 RIPA（含 1mM pmsf）冰冷。

將組織切成小片，對于約 20 mg 的組織，將約 250 μl 裂解緩沖液快速加入管中，用電動勻漿器（或玻璃勻漿器）勻漿直至全裂解。

在微量離心機中于 4°C 下以 10000~14000g 離心 5 分鐘。輕輕地從離心機中取出管子并置于冰上，吸出上清液并置于冰上保存的新管中；丟棄顆粒。

蛋白質濃度的測定：

使用 PAGE 凝膠、Bradford 測定、Lowry 測定或 BCA 測定。牛血清白蛋白（BSA）是一種常用的蛋白質標準品。

制備用于加載到凝膠中的樣品：

要變性，請使用帶有陰離子變性去污劑十二烷基硫酸鈉 (SDS) 的上樣緩沖液，并將混合物在 95-100°C 下煮沸 5 分鐘。

1. 清潔玻璃并設置電泳系統。

2. 制備PAGE膠，根據蛋白質的分子量選擇不同濃度的分離膠：

1. 4%堆積膠，選擇預染色的蛋白質Marker Proteins的大小，以幫助區分蛋白質大小和電泳示蹤劑。

2. 上樣跑膠，每孔加樣量20-40μg蛋白，加樣時注意不要溢出到相鄰孔中，造成膠戳孔和交叉污染。

3. 按照電泳方法推薦的說明進行電泳，當溴酚藍將凝膠耗盡時終止凝膠電泳。

1. 將蛋白質從凝膠轉移到膜上。 （根據trans-blot系統推薦的說明。）

2. 查看膜中的蛋白質：麗春紅。轉印后，用麗春紅染料染色約2～5min，檢查轉印是否成功。然后用蒸餾水沖洗掉染料。

3. 封閉膜一般用5%脫脂牛奶，或3%~5% BSA。 4 ℃搖床振蕩封閉過夜，或37 ℃封閉2小時。封閉后TBS洗滌5-10秒。 

4. 與一抗一起孵育。按照推薦的抗體稀釋度，用TBST（或1%~3%脫脂牛奶）稀釋抗體。然后將膜裝入自封袋和固定層壓機中，將抗體溶液添加到自封袋中，并確保膜與足夠體積的抗體一起孵育。

5. 37℃振蕩孵育1～3 h（根據抗體效價和親和力），或4℃過夜孵育，TBST室溫搖床上洗3次，每次5～10 min。

6. 與二抗孵育，同步驟(4)，用TBST稀釋，37℃振蕩孵育1～3 h。

HRP 偶聯抗體的化學發光、顯影和固定：ECL 是使用的傳統試劑盒。

在暗室中，將顯影劑和固定劑分別裝入塑料托盤中，在離心管中混合兩種試劑（A 和 B 的體積）。確保膜表面蛋白與混合物充分接觸。 1~2分鐘后去除殘留物。

紅燈處取出膠片，打開膠片夾，將膠片放在膠片上，取下膠片夾，根據信號強度調整曝光時間，記住曝光過度的膠片不適合分析。

曝光完成后，取出膠片，迅速浸入顯影液中，終止顯影。顯影后，應立即將膠片浸入定影液中成透明膜。用自來水清洗除去殘留的固定劑后，在室溫下干燥。