| 品牌 | 其他品牌 | 貨號 | APP-101-FAMX |
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| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業,制藥 |
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jenabioscience:高保真熒光素PCR標記試劑盒——PCR法制備熒光素標記的DNA探針
Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一組科學家于1998年成立，利用超過25年的學術知識為100多個國家的研究和行業客戶開發創新試劑。
供一般實驗室使用。
運輸:凝膠包裝運輸
儲存條件:儲存在-20°C
避免冷凍/解凍循環，避光儲存
保質期:12個月
光譜特性: λexc492納米，λ全身長的517納米，ε 83.0毫摩爾-1厘米-1(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH 7.5)
描述:
高保真熒光素PCR標記試劑盒設計用于通過PCR隨機產生熒光素修飾的DNA探針。這種探針非常適合熒光原地的雜交(FISH)和Northern印跡實驗。如果模板量有限或需要擴增特定的DNA片段，基于PCR的標記優于用Klenow片段的隨機引物標記。高達4kb的探針擴增是可行的。
使用優化的反應緩沖液和高保真聚合酶混合物，熒光素-12-dUTP作為其天然對應物dTTP的替代物被有效地摻入到DNA中，所述高保真聚合酶混合物包括Taq聚合酶和校對酶。50 %熒光素-12-dUTP取代通常導致反應和標記效率之間的最佳平衡。然而，熒光素-12-dUTP/dTTP比率的個體優化可以容易地用單核苷酸形式實現。
該試劑盒包含足夠的試劑，可用于10次標記反應(S-Pack)或50次標記反應(L-Pack)，每次20μL(50%熒光素-12-dUTP替代，100微米dATP/dGTP/dCTP，50微米dTTP，50微米熒光素-12-dUTP)。
內容:
高保真聚合酶
在含有50%甘油(v/v)的儲存緩沖液中
# APP-101-FAMX-S:1個40微升(100個單位，2.5個單位/微升)
# APP-101-FAMX-L:2個40微升(2個100單位，2.5單位/微升)
高保真標記緩沖液
1個500微升(10倍)
dATP溶液
1個20微升(100毫米)
dGTP解決方案
1個20微升(100毫米)
dCTP溶液
1個20微升(100毫米)
dTTP溶液
1個20微升(100毫米)
熒光素-12-dUTP
# APP-101-FAMX-S:1個10微升(1毫米)
# APP-101-FAMX-L:5個10微升(1毫米)
DNA
1個20微升(100納克/微升)
500 bp正向引物
1個20微升(10微米)
500 bp反向引物
1個20微升(10微米)
PCR級水
1x 1.2毫升
由用戶提供
DNA模板
底漆
DNA純化工具(可選)
1.工作溶液的制備
1.1 1mM dATP/dCTP/dGTP工作溶液的制備
- 將100 mM dATP、100 mM dCTP和100 mM dGTP溶液在冰上、voretex上解凍，并短暫旋轉。
- 用PCR級水制備1:100的稀釋液，以達到1 mM的最終濃度(例如2μl 100mM dATP+2μl 100mM dCTP+2μl 100mM dGTP+194μl PCR級水)。
- 1 mM ATP/CTP/GTP工作溶液可儲存在-20°c下。準備等分試樣以避免冷凍/解凍循環。
1.2 1mM dTTP工作溶液的制備
- 在冰上融化100 mM dTTP溶液，voretex并短暫旋轉。
- 用PCR級水制備1:100的稀釋液，以達到1 mM的最終濃度(例如2 μl 100 mM dTTP + 198 μl PCR級水)。
- 1 mM dTTP工作液可儲存在-20°c下。準備等分試樣以避免冷凍/解凍循環。
3.標準PCR標記方案
標準方案用于標記500 bp的DNA片段。反應和標記效率之間的最佳平衡通常是按照下面的標準方案用50%熒光素-12-dUTP取代來實現的，然而，個體優化可能改善個體應用的結果。
- 按照下列順序在冰上組裝PCR(無脫氧核糖核酸酶反應管)。
- Voretex和簡單的降速。
- 在弱光條件下進行檢測設置和反應。
| 成分 | 卷 | 最終概念 |
| PCR級水 | X μl |
|
| 高保真標記緩沖液(10x) | 2微升 | 1x |
| 1 mM dATP/dCTP/ dGTP工作溶液(s. 1.1) | 2微升 | 100微米 |
| 1 mM dTTP工作溶液(s. 1.2) | 1微升 | 50微米 |
| 1 mM熒光素-12-dUTP | 1微升 | 50微米 |
正向引物
(10微米) | X μl | 0.1 - 1微米(例如0.3微米500 bp正向引物) |
反向引物
(10微米) | X μl | 0.1 - 1微米(例如0.3微米500 bp反向引物) |
| 模板dna | X μl | 1 - 10 ng基因組DNA(例如1 ngλDNA) |
| 高保真聚合酶(2.5單位/微升) | 1微升 | 2.5單位 |
| 總體積 | 20微升 |
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推薦的騎行條件
| 循環步驟 | 溫度 | 時間 | 周期 |
最初的
變性 | 95攝氏度 | 2分鐘 | 1x |
變性
熱處理1)
延長2) | 95攝氏度
58攝氏度
68攝氏度 | 20秒
30秒
60秒 | 30x |
最后的
延長 | 68攝氏度 | 2分鐘 | 1x |
1)退火溫度取決于所用引物的熔化溫度。
2)延伸時間取決于待擴增片段的長度。建議時間為2分鐘/kbp。72°C時的伸長率也同樣有效。
為了獲得最佳擴增結果和高摻入率，對于每個新的引物-模板對，可能需要對推薦的PCR檢測和循環條件進行單獨優化。
4.探針純化:
大多數雜交實驗不需要探針純化。如果下游應用需要純化(例如通過吸光度測量進行濃度測定)，我們建議采用基于硅膠膜或凝膠過濾的純化方法。
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